7月中旬本公众号发表了小六儿总结免疫荧光新手攻略（新手细胞免疫荧光实验常见问题解答），从细胞密度（铺板密度、方式、种板时间）及一抗选择及处理，DAPI及封片过程总结了新手掌握免疫荧光实验的基本准则。其核心注意事项总结如下 ：4、双标染色：应当将种属来源区分开，二抗的颜色也要区分开；6、细胞免疫荧光最好不封片，新手很容易在最后一步功亏一篑；7、如果要观察时间梯度的变化，尽量不用一次性观察好几个时间组，一次只观察1-2组，不会影响荧光效果。就如上新手进阶要点总结之后，笔者总结了一下免疫荧光需要特别关注的细节，以期作出更完美的图片效果。例如：下图使用肺动脉内皮细胞（ BPAE ）观察线粒体的显色，采用405nm，488nm，561nm的激光，100x NA 1.49 的物镜对细胞内线粒体的分布进行简单的观察，此图可见，单纯的mito-tracker并不能清晰看见线粒体内部的结构和蛋白相关关系，因此，明确蛋白定位，根据所需分辨率选择显微镜、相应的荧光蛋白和探针非常重要。比如研究者应大致预测观察目标是存在于线粒体外膜表面，或者线粒体嵴上，或者仅需观察经处理后线粒体的形态及分布以选择不同的荧光蛋白/荧光有机小分子探针/纳米荧光探针等（一般来说荧光蛋白比小分子荧光探针体积更大，在超微显像过程中较大小分子荧光探针等更有利于显微结构的染色）。
（图由作者提供，仅供示例，禁止用于其他用途，下同）
一张清晰的研究图片应当避免过多的干扰光点出现。在免疫荧光实验中，应尽量保证每次PBS清洗次数和时间，减少杂质。细胞免疫荧光相比较于组织免疫荧光略有区别，一抗应在孔板内完成孵育步骤，载玻片上孵一抗时免疫组化笔干燥结块脱落会引起再爬片杂光。
此外尽量保证盖玻片的洁净非常重要。经伽马射线处理的盖玻片应为免疫荧光的首选材料（但价格昂贵），普通的生物研究者可以google一下简单但硅烷化处理protocol，提前处理好盖玻片（使盖玻片表面疏水且带有正电荷），对于有高分辨率要求的荧光实验，此步骤非常关键。
常用的荧光图片保存方法抗荧光淬灭剂必不可少，笔者觉得DAKO和invitrogen的抗荧光淬灭剂非常好用，比较起来，invitrogen的性价比更高。国产的抗荧光淬灭剂目前还没有试到特别好用的品牌。除了抗淬灭剂外，手动在抗淬灭剂里添加一点叠氮化钠，抗淬灭效果更优。细胞荧光实验淬灭剂不可以过多，否则影响后期拍摄。经过良好保存的免疫荧光片子，在常温下放3-6个月一般来说还可以拿出来拍片（个人经验），遇到过特别优秀的师兄荧光片放了3年重新照相还是清晰明了。以上就是蘑菇小姐总结的免疫荧光实验中小细节，仅为个人经验，欢迎批评指正，谢谢。· 新手细胞免疫荧光实验常见问题解答
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